¿Cómo extraer la ficocianina de la espirulina?
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¿Cómo extraer la ficocianina de la espirulina?

Número Navegar:0     Autor:Gigi     publicar Tiempo: 2021-10-25      Origen:motorizado

Extracción deficocianinade espirulina

Principio del experimento.

1. Método de congelación: congelar las células a baja temperatura para un cierto Período de tiempo, luego sáquelos y descongele a temperatura ambiente. Repetido Congelación y descongelación durante muchas veces, las células pueden hincharse y romperse mientras se forman. Partículas de hielo y aumentar la concentración de la sal citosólica restante.

2. Método de salazón: los iones positivos y negativos formados por el La ionización de la sal en la solución acuosa puede atraer moléculas de agua, por lo tanto. destruyendo la película de salpicaduras de la proteína, la parte neutralizante de la carga, y haciendo que la proteína se agregue y precipite y precipite fuera de la solución. Debido a la diferencia en el tamaño de varias partículas de proteínas, la cantidad de carga y el grado de hidrofilicidad, cuando una cierta sal neutral Se utiliza para sallar, la concentración de sal mínima requerida varía.

3. DEAE-CELULULOSE: NOMBRE DE INGLÉS DEAE-CELULULOSE, DITHYLAMINOTHYL Celulosa, capacidad de intercambio total 0.9MEQ / G Grupo funcional: dietilaminoetilo. Intercambiador de aniones débilmente básico. Principio: Contiene ciertos grupos funcionales, que puede intercambiarse ion. El rendimiento es más suave que el del ion general. Resinas de intercambio. Es adecuado para la separación de biológicamente activo. Macromoléculas y pueden separar sustancias macromoleculares con similares. Propiedades.


Extracción de fincoanina

Extracción C-Phycocyanin de la biomasa húmeda de espirulina platensis

Pasos experimentales

1. Extracción de ficocianina.

Tomar 10 g de polvo de espirulina, vierta en una botella de plástico, agregue 100 ml de Extraer, sellar la boca de la botella y congelar a baja temperatura (-20 ℃) ​​para un Cierto período de tiempo, luego sáquelo y deje que se derrita a temperatura ambiente, Luego colóquelo a baja temperatura (-20 ℃), tal congelación y descongelación repetida Tres veces, las células pueden hincharse y romperse mientras forman partículas de hielo y Aumentar la concentración de la citosalt restante. Fenómeno experimental: Antes de descongelar: sólido verde oscuro (ligeramente púrpura) después de descongelar: la solución obtenido por congelación y descongelación de la solución verde oscuro se centrifugó dos veces a 4000 rpm durante 10 minutos para obtener un sobrenadante azul brillante, que fue recogido en un pequeño vaso y descartado la capa inferior es verde oscuro precipitación.


Proceso de extracción de fycocianina para uso a gran escala.

Precipitación de la ficocianina por método de salazón

1. Producción de la curva de salazón de la ficocianina.

Tome seis tubos de ensayo numerados 1-6, agregue 5 ml del extracto inicial respectivamente, agregue solución saturada de sulfato de amonio (69.7g sulfato de amonio a 100 ml de solución) 2, 3, 4, 5 ml en el tubo de ensayo 1-4, y luego agregue agua destilada 3. 2, 1, 0ml, agregue 0.66 y 1.37 g de sulfato de amonio sólido a los tubos de ensayo 5-6, Luego agregue 5 ml de solución saturada de sulfato de amonio, agite bien para disolver, poner En el refrigerador durante más de media hora, lo puso en una centrífuga en 4000RPM 10min, recoger el precipitado y disolver el precipitado con 5 ml, 0.02mol / L pH6.5 tampón de fosfato. Tomar la saturación de sulfato de amonio como el la abscisa y la concentración de la ficobiliproteína como ordenada para trazar el Curva de salazón de fincoanina.


C = (A620-0.474A650) /5.34 (mg / ml)


A620 y A650 son la absorbancia a 620 y 650 nm, respectivamente, ajustados a cero con tampón de fosfato.


Purificación de Phycobiliprotein

  1. Pesar (NH4) 2SO4 en polvo sólido, agregarlo lentamente a un vaso pequeño varios veces, y agita mientras se agrega para hacer la saturación de la solución de (NH4) 2SO4 alcance 20% (11.4%). Colóquelo en el refrigerador durante media hora, centrifugue a 4000 RPM durante 10 min, después de la sedimentación centrífuga, obtener un azul brillante sobrenadante, y descartar el precipitado azul. Añadir sulfato de amonio para hacer el (NH4) 2SO4 La concentración de la solución alcanza el 50% (31.3%, deduce la cantidad de Sulfato de amonio añadido antes). Después de la centrifugación y la sedimentación a una alta. Velocidad a 4000 rpm durante 10 min, se obtiene un precipitado azul oscuro, y el Supernadante amarillo-verde es descartado. Añadir no más de 15 ml de agua destilada. para disolver el precipitado resultante para su uso posterior (la cantidad de agua es como Poco más posible, lo que es propicio para la diálisis).


2. Corte una bolsa de diálisis a unos 25 cm de largo, póngala en un vaso y hierva por 5 minutos (tiempo desde el momento en que el agua está hirviendo), ate un extremo con un delgado Hilo, doblo por la mitad y átalo con un hilo delgado. Vierta el previamente Solución disuelta y precipitada en la bolsa de cromatografía. Ponerlo en Agua destilada y cambia el dializado cada hora. Después de la diálisis, póngalo en PEG-6000 partículas sólidas para la concentración.


3. Tome una columna de cromatografía, límpielo después de la detección de fugas y solucione En el soporte de hierro con dos abrazaderas de hierro. Compruebe si es vertical de la Delantero y el lado, y ajústelo si no es vertical. Pesar 20g Deae-celulosa-52 en un vaso, hincharse con NaCl 0.5M y una solución de NaOH de 0.5M para 20 minutos, y luego lavar con agua destilada hasta que sea neutral. Entonces usa Solución de 0.5MCL para oler durante 20 minutos, y luego lavar con agua destilada. Hasta que sea neutral. Finalmente, equilibre con 0.02M, pH6.5 tampón de fosfato durante la noche. Revuelva la solución suavemente y vierta uniformemente en la columna. Allí debe ser un espacio de 2 ~ 3 cm en la superficie del líquido en la columna, y luego cada El tiempo la superficie líquida se mueve hacia la posición de escala original, el agua es añadido a la altura correspondiente, de modo que el agua destilada es siempre más de 2 cm más alto que el relleno.


4. Suelte el búfer en la columna de cromatografía preparada, y apague El interruptor de la columna cuando el nivel de líquido es solo aproximadamente 1 cm más alto que el relleno. Use un gotero de punta de goma para aspirar el extracto de fincoanina de crudo de diálisis, extenderlo a la superficie del líquido de la columna, suelte el extracto de crudo a lo largo la pared del tubo a una velocidad muy lenta hasta la mitad de la superficie del líquido, y Acelera el goteo después de que se levante el nivel de líquido. Aceleración. Cuando el El nivel de líquido está a solo 2 cm de distancia de la boca de la columna, encienda el interruptor Completamente y continúa goteo del extracto crudo.


5. Cuando el nivel de líquido del extracto crudo es solo aproximadamente 1 cm más alto que El relleno, agregue 50 ml, 0.02m, pH6.5 Solución de tampón de fosfato gota a gota a enjuague El extracto crudo restante. No lo agregue a la vez, pero primero agrega un pequeño cantidad para enjuagar el extracto crudo restante limpio (hasta que la solución esté clara), y luego agregar una gran cantidad. Finalmente, agregue 0.5M NaCl-0.02M, pH6.5 fosfato buffer.


6. Observa con cuidado. Cuando la solución azul claro fluye, comienza Recoger de inmediato, 2 ml un tubo (recogiendo 10 tubos en total). Después de la Se recoge el tubo de ensayo, el color de la solución en los cambios de tubo de ensayo: Luz → Oscuridad → Luz Tome la solución de tampón fosfato como el control en blanco TUBO, y use un espectrofotómetro para medir su A620NM y A650NM.


7. Calcule la concentración de fincocianina de cada tubo según A620nm y A650nm.

Determinación: la concentración o actividad de cada tubo de solución. Se determinará entonces recolectado. Según los resultados de la medición, el Se puede dibujar la curva de elución (usando el número del tubo o el volumen de elución como el abscisa, y la concentración de cada tubo de la muestra de la solución como el ordenar)